高效液相色譜法是什么？

高效液相色譜法是20世紀(jì)60年代后期發(fā)展起來的一種分析方法，以經(jīng)典的液相色譜為基礎(chǔ)，是以高壓下的液體為流動(dòng)相的色譜過程。

通常所說的柱層析、薄層層析或紙層析就是經(jīng)典的液相色譜。所用的固定相為大于100um的吸附劑(硅膠、氧化鋁等)。這種傳統(tǒng)的液相色譜所用的固定相粒度大，傳質(zhì)擴(kuò)散慢，因而柱效低，分離能力差，只能進(jìn)行簡單混合物的分離。而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、傳質(zhì)快、柱效高。

高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論；在技術(shù)上，流動(dòng)相改為高壓輸送(最高輸送壓力可達(dá)29.4MPa)；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜(每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬)；同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器，可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。

高效液相色譜的特點(diǎn)

? 高壓

液相色譜法以液體為流動(dòng)相(稱為載液)，液體流經(jīng)色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過色譜柱，必須對(duì)載液施加高壓。一般可達(dá)150～350×105Pa。

? 高速

流動(dòng)相在柱內(nèi)的流速較經(jīng)典色譜快得多，一般可達(dá)1-10ml/min。高效液相色譜法所需的分析時(shí)間較之經(jīng)典液相色譜法少得多，一般少于1h 。

? 高效

HPLC的分離效率高于普通液相色譜，在發(fā)展過程中又出現(xiàn)了許多新型固定相，使分離效率大大提高。

? 高靈敏度

高效液相色譜已廣泛采用高靈敏度的檢測(cè)器，進(jìn)一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測(cè)器靈敏度可達(dá)10-11g。另外，用樣量小，一般微升。

? 適應(yīng)范圍寬

氣相色譜法與高效液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，但是受技術(shù)條件的限制，沸點(diǎn)太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行分析。而高效液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要?dú)饣虼瞬皇茉嚇訐]發(fā)性的限制。對(duì)于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、相對(duì)分子量大(大于400以上)的有機(jī)物(這些物質(zhì)幾乎占有機(jī)物總數(shù)的75%-80%)原則上都可應(yīng)用高效液相色譜法來進(jìn)行分離、分析。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70%-80%。

高效液相色譜的組成

由溶劑輸送系統(tǒng)(脫氣機(jī)、高壓泵等)、進(jìn)樣系統(tǒng)(定量泵、六通閥、定量環(huán)、進(jìn)樣針等)、分離系統(tǒng)(色譜柱等)、檢測(cè)系統(tǒng)(檢測(cè)器等)、記錄及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。

? 高壓輸液系統(tǒng)

將流動(dòng)相在高壓下連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng)，具有足夠的壓力，輸出流量恒定、可調(diào)，輸出壓力平穩(wěn)，泵室體積小，泵體抗腐蝕、耐酸等特點(diǎn)。

壓力平穩(wěn)、流速恒定是系統(tǒng)穩(wěn)定、重現(xiàn)性良好的前提條件，多數(shù)的HPLC故障、色譜數(shù)據(jù)異常均會(huì)表現(xiàn)出壓力異常，如偏高、偏低、波動(dòng)大等，在日常使用中需特別關(guān)注壓力變化。

? 在線脫氣機(jī)

四元低壓系統(tǒng)屬于泵前混合，由于在常壓下混合，易產(chǎn)生氣泡，必須配有在線脫氣機(jī)，并要求流動(dòng)相使用前進(jìn)行脫氣。

流動(dòng)相脫氣方法有低壓脫氣法(電磁攪拌、水泵抽空，可同時(shí)加熱或向溶劑吹氮?dú)?、吹氦氣脫氣法和超聲波脫氣法等。

流動(dòng)相脫氣目的：

? 使色譜泵輸液均勻準(zhǔn)確，減小脈動(dòng)；

? 提高保留時(shí)間和色譜峰面積的重現(xiàn)性；

? 防止氣泡引起尖峰；

? 使基線穩(wěn)定，提高信噪比；

? 降低溶劑的紫外吸收本底；

? 減少死體積；

? 防止填料氧化。

? 進(jìn)樣系統(tǒng)

(1)手動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)

定量環(huán)用于準(zhǔn)確定量，分為5μl、10μl、20μl等，需要根據(jù)不同進(jìn)樣量選擇合適的定量環(huán)。

(2)自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)

儀器自帶定量環(huán)多為100μl，如進(jìn)樣量大于定量環(huán)體積需咨詢相應(yīng)儀器工程師更換定量環(huán)及計(jì)量泵等，六通閥是理想的進(jìn)樣部件，其由圓形密封墊(轉(zhuǎn)子)和固定底座(定子)組成，通過閥切換保證恒定的流速。

分析液相多數(shù)配自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)，因其具有進(jìn)樣精度高、重現(xiàn)性好、可用于大量樣品分析等特點(diǎn)；也要求具有良好的密封性，小的死體積，好的穩(wěn)定性，進(jìn)樣時(shí)對(duì)色譜系統(tǒng)壓力、流量影響較小。

? 分離系統(tǒng)

包括色譜注、柱溫箱、連接管線等部件。

(1)色譜柱

色譜柱是實(shí)現(xiàn)分離的核心部件，由柱管和固定相組成。柱管為直型不銹鋼管，一般色譜柱長5-30cm，內(nèi)徑4-5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3-12mm，而制備色譜柱內(nèi)徑則可達(dá)25mm。一般淋洗溶劑在進(jìn)入色譜分離柱之前，先通過前置柱。HPLC柱的填料顆粒粒徑一般約為3-10m，填充常采用勻漿法，色譜柱的發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求需要選擇不同填料、不同規(guī)格的色譜柱。

(2)柱溫箱

保證分離系統(tǒng)的溫度恒定，降低溫度波動(dòng)對(duì)色譜基線、保留時(shí)間及色譜分離的影響，包括普通柱溫箱及帶有冷卻功能的柱溫箱，普通柱溫箱可根據(jù)方法需求設(shè)定高于室溫的溫度(一般應(yīng)高于室溫5℃以上)，降低柱壓或是改善色譜分離，帶有冷卻功能的柱溫箱可以升高柱溫外，還可以設(shè)定低于室溫的溫度，預(yù)防穩(wěn)定性差樣品的降解，各品牌柱溫箱的控溫范圍略有差別，需要通過相應(yīng)產(chǎn)品說明書或咨詢了解。需注意：有些品牌的柱溫箱是沒有配置預(yù)加熱模塊的，對(duì)于溫度敏感的樣品需要在柱前連接一段管線，對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行預(yù)加熱，管線長度及內(nèi)徑需適當(dāng)，盡量降低死體積。

? 檢測(cè)系統(tǒng)

用來連續(xù)監(jiān)測(cè)經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置，包括紫外可見吸收檢測(cè)器(UVD)、熒光檢測(cè)器(FD)、蒸發(fā)光檢測(cè)器(ELSD)、示差折光檢測(cè)器(RID)、電化學(xué)檢測(cè)器(ED)、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器(CD)、質(zhì)譜檢測(cè)器(MS)等類型，其技術(shù)要求為靈敏度高、噪音低、線形范圍寬、響應(yīng)快。

(1)紫外可見吸收檢測(cè)器(UVD)

波長范圍190-800mm，190-400mm為紫外區(qū)域，氘燈；400-800mm為可見光區(qū)域，鎢燈。其特點(diǎn)為靈敏度高，最小檢測(cè)濃度10-9g/ml，線性范圍寬，對(duì)溫度和流速不敏感，可進(jìn)行梯度洗脫，應(yīng)用范圍廣。適用于帶有共軛基團(tuán)的化合物，為最常用的檢測(cè)器。

(2)熒光檢測(cè)器(FD)

氘燈作激發(fā)光源，波長范圍250-600nm。其特點(diǎn)為靈敏度更高，檢測(cè)限10-12～10-13g/ml(靈敏度比UV檢測(cè)器高2-3個(gè)數(shù)量級(jí))，選擇性好，對(duì)溫度和流速不敏感，可進(jìn)行梯度洗脫，所需試樣量少，適于痕量分析，應(yīng)用于組分吸收一定波長紫外光后發(fā)射熒光的物質(zhì)，且熒光強(qiáng)度與濃度成正比。

(3)蒸發(fā)光檢測(cè)器(ELSD)

一種通用型檢測(cè)器，可檢測(cè)揮發(fā)性低于流動(dòng)相的任何樣品，而不需要樣品含有發(fā)色基團(tuán)。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器靈敏度比示差折光檢測(cè)器高，對(duì)溫度變化不敏感，基線穩(wěn)定，適合與梯度洗脫液相色譜聯(lián)用。被廣泛應(yīng)用于碳水化合物、類脂、脂肪酸和氨基酸、藥物以及聚合物等的檢測(cè)。其主要缺點(diǎn)為響應(yīng)值與濃度不呈線性，需取響應(yīng)值的對(duì)數(shù)與濃度計(jì)算線性。

(4)示差折光檢測(cè)器(RID)

一種連續(xù)檢測(cè)樣品流路與參比流路間液體折光指數(shù)差值的通用型檢測(cè)器，其優(yōu)點(diǎn)為對(duì)糖類檢測(cè)靈敏度較高，其檢測(cè)限可達(dá)10-8g/ml；穩(wěn)定性好，操作方便，缺點(diǎn)該檢測(cè)器對(duì)多數(shù)物質(zhì)的靈敏度低(約10-5g/ml)，通常不用于痕量分析；受環(huán)境溫度、流動(dòng)相組成等波動(dòng)的影響大，不適合梯度洗脫。

(5)質(zhì)譜檢測(cè)器(MS)

將樣品中的分析物電離，不同質(zhì)量離子在電場或磁場中，將按其質(zhì)量和所帶的電荷比(質(zhì)荷比，m/z)進(jìn)行的分離和排序，根據(jù)質(zhì)荷比的大小和相對(duì)強(qiáng)度形成規(guī)則的質(zhì)譜，從而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒別和定量分析。質(zhì)譜分析具有靈敏度高，樣品用量少，分析速度快，分離和鑒定同時(shí)進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn)，但流動(dòng)相中不能含有無機(jī)鹽。

氣相色譜法的核心知識(shí)點(diǎn)

? 高效液相色譜法對(duì)流動(dòng)相的要求

流動(dòng)相不與色譜柱發(fā)生不可逆化學(xué)變化，以保持柱效或柱子的保留性質(zhì)較長時(shí)間不變；對(duì)待測(cè)樣品有足夠的溶解能力，與所用檢測(cè)器相匹配；粘度盡可能小，以獲得較高的柱效；流動(dòng)相純度要高，價(jià)格便宜，毒性小。

? 高效液相色譜法按固定相承受壓力分類

(1)剛性固體

以二氧化硅為基質(zhì)，可承受較高壓力，表面可鍵合各種功能官能團(tuán)——鍵合固定相，是目前應(yīng)用廣泛的固定相。

(2)硬膠

主要用于離子交換色譜法和凝膠色譜法中，由聚苯乙烯與二乙烯基苯交聯(lián)而成，可承受的壓力較低。按孔隙深度分：

①表面多孔型

基體是球形玻璃珠，在玻璃表面涂覆一層多孔活性物質(zhì)如硅膠、氧化鋁、聚酰胺、離子交換樹脂、分子篩等。適用于快速分離、填充均勻緊密、機(jī)械強(qiáng)度高、能承受高壓，適于簡單的樣品及常規(guī)分析；缺點(diǎn)是多孔層薄，進(jìn)樣量受限制。

②全多孔型

由硅膠顆粒聚集而成，比表面積大，柱容量大，小顆粒全孔型固定相孔洞淺傳質(zhì)速率快，柱效高，分離效果好，適合于復(fù)雜樣品、痕量組分的分離分析，是目前HPLC中應(yīng)用廣泛的固定相。

? 液固吸附色譜法原理

以固體吸附劑為固定相，吸附劑表面的活性中心具有吸附能力，試樣分子被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)時(shí)，它將與流動(dòng)相溶劑分子在吸附劑表面發(fā)生競爭吸附。分離過程是一個(gè)吸附-解吸的平衡過程。

? 液固吸附色譜法固定相

通常是硅膠、氧化鋁、活性炭等固體吸附劑，硅膠最常用；流動(dòng)相：極性大的試樣需用極性強(qiáng)的洗脫劑，極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。應(yīng)用：幾何異構(gòu)體分離和族分離，如農(nóng)藥異構(gòu)體；石油中烷、烯、芳烴的分離。不適于強(qiáng)極性的離子型樣品的分離，不適于分離同系物(因?yàn)?，它?duì)相對(duì)分子質(zhì)量的選擇性較小)。

? 液液分配色譜法原理

根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶(或部分互溶)的液體中溶解度的不同實(shí)現(xiàn)分離，分配系數(shù)較大的組分保留值也較大。

? 液液分配色譜法流動(dòng)相

流動(dòng)相與固定液應(yīng)盡量不互溶，或者二者的極性相差越大越好。根據(jù)流動(dòng)相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為正相分配色譜(流動(dòng)相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于強(qiáng)極性和中等極性組分分離)和反相分配色譜(流動(dòng)相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性或弱極性組分分離)。固定相：由載體和固定液組成。常用的固定液有b，b’-氧二丙腈、聚乙二醇、聚酰胺、正十八烷、角鯊?fù)榈?。?yīng)用：同系物組分的分離。例如分離水解蛋白質(zhì)所生成的各種氨基酸，分離脂肪酸同系物等。

? 化學(xué)鍵合固定相

化學(xué)鍵合固定相是利用化學(xué)反應(yīng)將有機(jī)分子鍵合到載體表面上，形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成各種性能的固定相。

? 化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)

固定相不易流失，柱的穩(wěn)定性和壽命較高；能耐受各種溶劑，可用于梯度洗脫；表面較為均一。沒有液坑，傳質(zhì)快，柱效高；能鍵合不同基團(tuán)以改變其選擇性。例如鍵合氰基、氨基等極性集團(tuán)用于正相色譜法，鍵合離子交換基團(tuán)用于離子色譜法，鍵合C2、C4、C6、C8、C18、C16、C18、C22烷基和苯基等非極性基團(tuán)用于反相色譜法等。因此它是HPLC較為理想的固定相。

? 離子交換色譜法原理

離子交換色譜法的固定相是離子交換樹脂，流動(dòng)相是水溶液，它是利用待測(cè)樣品中各組分離子與離子交換樹脂的親和力的不同而進(jìn)行分離的。

? 離子交換色譜法流動(dòng)相

水的緩沖溶液，陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。

? 凝膠色譜法原理

凝膠色譜法的固定相為多孔性凝膠類物質(zhì)，流動(dòng)相為水溶液或有機(jī)溶劑，它是根據(jù)不同組分分子體積的大小進(jìn)行分離的。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰；可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離。

? 凝膠色譜法流動(dòng)相

能溶解樣品且與凝膠相似(潤濕凝膠并防止吸附作用)、粘度小(增加擴(kuò)散速度)。常用四氫呋喃、苯、氯仿、水等。

? 影響分離的因素與提高柱效的途徑

(1)液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍左右，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑；

(2)由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效；

(3)液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)；

(4)恒溫改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素；

(5)流速大于0.5cm/s時(shí)，H-u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實(shí)際操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整分離度和出峰時(shí)間的重要可選擇參數(shù)；

(6)氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。